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更新時間：2022-04-21
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【產(chǎn)品名稱】
商品名： 豬藍耳病毒經(jīng)典型/豬藍耳病毒 NADC30 株(PRRSV-C/PRRSV-NADC30)核酸檢測試劑盒(雙重熒光PCR 法)
Name ： Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome classical type and NADC30 type Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】 豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS)，又稱藍耳病，是由豬繁殖 與呼吸綜合征病毒引起豬的高度接觸性傳染病，是影響世界養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。 本試劑盒適用于檢測豬扁桃體、腦組織、血液等標本中的豬藍耳病毒經(jīng)典型和豬藍耳病毒 NADC30 株， 適用于這 2 種病原感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查。
【檢驗原理】 本試劑盒分別根據(jù)豬藍耳病毒經(jīng)典型和豬藍耳病毒 NADC30 株基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針，用一 步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對這 2 種病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
| 包裝規(guī)格 | 50T/盒 |
| PRRSV-C/-NADC30反應液 | 500μL×2 管 |
| 酶液 | 50μL×1 管 |
| PRRSV-C/-NADC30 陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
| 陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 9 個月。
【適用儀器】 ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P、Bio-Rad CFX96 等熒光定量 PCR 儀。
【標本采集】 病死或撲殺豬，取扁桃體和腦組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和運輸】 上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運 輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理 取組織樣品約 1g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；血液樣品取血清 100μL 提取。
1.2 核酸提取 推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按 照試劑說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)） 根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應 管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：
| 試劑 | PRRSV-C/-NADC30 反應液 | 酶液 |
| 用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。
3. 加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
| 步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
| 1 | 1cycle | 42℃ | 20min | 否 |
| 2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
| 3 | 40 cycle | 94℃ | 15sec | 否 |
| 55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖 像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷 FAM 通道為豬藍耳病毒經(jīng)典型檢測結(jié)果，CY5 通道為豬藍耳病毒 NADC30 株檢測結(jié)果 陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質(zhì)控標準 陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無 Ct 值； 陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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